剖析|你想要知道的數(shù)字PCR應(yīng)用及前景
一． PCR的發(fā)展歷史
PCR技術(shù)自問世以來(lái)，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。代 PCR在進(jìn)行擴(kuò)增后通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行定性分析。
隨著生物分子熒光技術(shù)的發(fā)展，1992年實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應(yīng)運(yùn)而生。qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以Ct值也就成為定量的依據(jù)。基于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術(shù)隨后逐漸發(fā)展為檢測(cè)核酸目標(biāo)片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù)。
在實(shí)時(shí)定量 PCR（qPCR） 過(guò)程中，熒光信號(hào)隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的積累而增強(qiáng)。qPCR 能夠?qū)崟r(shí)獲得模板擴(kuò)增的熒光值，然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長(zhǎng)時(shí)期的 Ct 值與標(biāo)準(zhǔn) DNA 的Ct值比較來(lái)計(jì)算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應(yīng)系統(tǒng)，非特異性的擴(kuò)增增加了假陽(yáng)性結(jié)果和背景信號(hào)，因此，終無(wú)法獲得定量的結(jié)果。
隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代PCR技術(shù)，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn)。digital PCR是一種新的定量PCR，主要是對(duì)PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。
圖1. PCR技術(shù)的發(fā)展歷程
二． 數(shù)字微流控（dPCR）的原理
20 世紀(jì)末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
dPCR是一種核酸分子定量技術(shù)。
dPCR一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴(kuò)增和熒光定量分析。
在PCR 擴(kuò)增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾萬(wàn)個(gè)反應(yīng)腔室里反應(yīng)。這樣子相當(dāng)于變相的對(duì)靶基因進(jìn)行富集。與此同時(shí)，由于對(duì)原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對(duì)初始PCR反應(yīng)物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。
不同于 qPCR對(duì)每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定的方法，dPCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。
圖2. dPCR基本原理
三. dPCR與qPCR的對(duì)比
相對(duì)于熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優(yōu)勢(shì)：
1、 靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子：檢測(cè)限低至0.001%，原因在于dPCR可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的富集；
圖3. dPCR可以實(shí)現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測(cè)
2、 無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)曲線），即可對(duì)靶分子起始量進(jìn)行定量；
3、 特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測(cè)：終點(diǎn)PCR檢測(cè)，不依賴Ct值，不依賴擴(kuò)增效率，能克服PCR抑制劑的影響，適合動(dòng)血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復(fù)雜樣品中DNA的定量；
4、 能夠有效區(qū)分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性，可以用于測(cè)定靶基因的相對(duì)表達(dá)，基因拷貝數(shù)變異分析等。
圖4. qPCR和dPCR的對(duì)比
四．dPCR的多指標(biāo)檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)
如同qPCR一樣，dPCR中實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)的并行檢測(cè)能顯著降低檢測(cè)成本，獲取更豐富的檢測(cè)信息。
不同于qPCR中的多腔室擴(kuò)增與多熒光通道結(jié)合的并行PCR方式，在dPCR里，一個(gè)微反應(yīng)腔室里一般只含一種靶基因。
圖5. dPCR的多指標(biāo)并行檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)方式
所以dPCR的多指標(biāo)檢測(cè)主要通過(guò)以下兩種方式實(shí)現(xiàn)：
1. 多個(gè)熒光通道。使用多種熒光染料來(lái)標(biāo)記不同的要檢測(cè)的靶基因。
2. 單波長(zhǎng)多強(qiáng)度。使用一種熒光染料，但是擴(kuò)增結(jié)束時(shí)不同的靶基因?qū)?yīng)的染料的熒光強(qiáng)度不一樣。
五．dPCR的分類以及相關(guān)的產(chǎn)品
微流控芯片技術(shù)能夠快速并準(zhǔn)確地將樣品流體分成若干個(gè)獨(dú)立的單元, 從而進(jìn)行多步平行反應(yīng)，并且具有成本低、體積小和高通量等特點(diǎn)，是理想的數(shù)字PCR平臺(tái)。按照其獨(dú)立的單元的實(shí)現(xiàn)方式來(lái)細(xì)分，dPCR又分為基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式PCR。
5.1微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）
微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續(xù)相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中，從而成液滴。這種液滴式的反應(yīng)腔室具有體積小、樣品間無(wú)擴(kuò)散等優(yōu)勢(shì)。
在ddPCR中，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬(wàn)乃至百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴，作為數(shù)字 PCR 的樣品分散載體。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應(yīng)液，然后將液滴收集在PCR反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增。ØPCR反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)。
目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。
圖6. Bio-Rad的droplet digital PCR系統(tǒng)
5.2 微陣列芯片式PCR
微陣列芯片式PCR主要通過(guò)芯片設(shè)計(jì)將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增后結(jié)果的熒光顯微鏡直接判讀。
按芯片設(shè)計(jì)方式，微陣列芯片式PCR又可以分為陣列微池式芯片、滑片式芯片和集成微泵閥芯片：
1. 陣列微池式芯片上刻蝕有微池陣列，反應(yīng)液由進(jìn)樣孔直接導(dǎo)入個(gè)反應(yīng)微池；
2. 滑片式芯片是設(shè)計(jì)帶有微流體通道和反應(yīng)單元的玻璃芯片，上下兩篇玻璃芯片間用油相密封，通過(guò)滑動(dòng)芯片將樣品溶液從液體通道引入反應(yīng)單元，同時(shí)生成成百上千個(gè)微反應(yīng)滴陣列；
3. 集成微泵閥式芯片是通過(guò)多層軟刻蝕技術(shù)在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，通過(guò)地控制微泵閥的開啟和關(guān)閉，快速并準(zhǔn)確地將流體分成若干個(gè)陣列的獨(dú)立單元。
2010年，Life Technologies也推出了基于陣列微池式芯片的數(shù)字PCR產(chǎn)品線–OpenArray系統(tǒng)。它提供的TaqMan OpenArray 數(shù)字PCR試劑盒可在OpenArray平板上運(yùn)行。平板可在現(xiàn)有的OpenArray 實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)以及新上市的QuantStudio™ 12K Flex儀器上運(yùn)行。OpenArray 實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)能夠同時(shí)運(yùn)行3塊OpenArray平板。
圖7. TaqMan® OpenArray® Digital PCR系統(tǒng)
Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流體通路（IFC）芯片的Bio-Mark™ 高通量基因剖析系統(tǒng)。
其創(chuàng)新在于集成液體通路技術(shù)：應(yīng)用集成電路制造工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，經(jīng)過(guò)不同的控制閥門控制溶液在其中的活動(dòng)來(lái)完成生物樣品的分液、混合、PCR擴(kuò)增。
圖8. Bio -Mark™ IFC芯片
六．dPCR的應(yīng)用前景
6.1 痕量核酸檢測(cè)
圖 9. 痕量核酸檢測(cè)的具體分類
dPCR尤其適合：對(duì)靈敏度要求非常高的核酸痕量分析研究；基質(zhì)復(fù)雜樣品中的核酸準(zhǔn)確定量（如組織、體液、排泄物等樣品）。
圖10. 痕量核酸檢測(cè)相關(guān)方法比較
6.1.1 癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)
在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關(guān)的突變序列比例較低，經(jīng)常無(wú)法檢測(cè)。而憑借其*高靈敏度，dPCR系統(tǒng)可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定檢測(cè)的樣本，現(xiàn)在可以使用dPCR輕松進(jìn)行定量分析。
是否能夠開發(fā)出有效的靶向治療藥物，與突變基因的檢測(cè)密切相關(guān)。其中（1）攜帶藥物作用突變位點(diǎn)的癌細(xì)胞百分比；（2）突變的特定等位基因是否可以被準(zhǔn)確檢測(cè)到，這兩點(diǎn)都直接影響到靶向治療是否有效。很顯然，在腫瘤均質(zhì)細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)單一突變相對(duì)簡(jiǎn)單，但是如果在異質(zhì)組織內(nèi)，在僅存有少量突變存在的情況下，如何準(zhǔn)確檢測(cè)出突變/稀有變異，或者針對(duì)于同一種癌癥中多種亞克隆的準(zhǔn)確鑒定，對(duì)個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
案列1. 實(shí)現(xiàn)肺癌相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測(cè)，可以更好地評(píng)估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。然而，由于其他技術(shù)檢測(cè)靈敏度有限，無(wú)法在高背景EGFR野生型中可靠地檢測(cè)到T790M突變。研究人員使用dPCR技術(shù)開發(fā)出度很高的檢測(cè)方法，以準(zhǔn)確定量T790M的濃度[1]。
圖11. ddPCR可以用EGFR突變的肺癌患者的血漿中游離DNA（cfDNA）為樣本，檢測(cè)與EGFR敏感性和藥物抗性相關(guān)的突變
6.1.2 致病微生物檢測(cè)
的病毒載量分析對(duì)于闡釋疾病病程，后續(xù)治療及療效評(píng)估是至關(guān)重要的。病毒載量的波動(dòng)，即使只下降了非常低的水平，意義卻是顯著的。在對(duì)病原體的研究中，能否實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。
案列2. 研究人員比較了 qPCR 和 dPCR 方法檢測(cè)臨床樣本中殘留的人類免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染嬰兒。研究人員發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞內(nèi)的 HIV DNA拷貝數(shù)時(shí)，相比于 qPCR，dPCR 的靈敏度提升了5倍；在檢測(cè)病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列時(shí)，dPCR比qPCR靈敏提升了20倍[2]。
案列3. 研究人員探索HBV血清學(xué)和ddPCR檢測(cè)結(jié)果與肝細(xì)胞癌（HCC）臨床分期和病癥之間的關(guān)系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在檢測(cè)FFPE處理的肝癌患者組織樣品中HBV DNA時(shí)，遇到的準(zhǔn)確度、靈敏度和重復(fù)性不足的缺點(diǎn)。進(jìn)而得出以下結(jié)論： 1、ddPCR的靈敏度和準(zhǔn)確度比real-time PCR更高——131個(gè)待測(cè)樣品中HBV DNA濃度范圍為1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24個(gè)血清學(xué)檢測(cè)呈陰性的樣本中也檢測(cè)到了痕量的HBV DNA； 3、樣品中HBV DNA的含量與肝細(xì)胞癌（HCC）組織的臨床分期一致； 4、ddPCR技術(shù)可以用于肝癌的早期無(wú)創(chuàng)診斷，病程監(jiān)控，肝移植、化療或免疫抑制的療效評(píng)估[3]。
6.2 與新一代測(cè)序（NGS）的無(wú)縫對(duì)接
相對(duì)于NGS， dPCR可以富集待測(cè)序樣品中的靶基因; dPCR還可以驗(yàn)證 / 定量測(cè)序結(jié)果。
圖12. ddPCR和NGS的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)
案列4. 由于人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在人體內(nèi)的含量極低，所以目前應(yīng)用于臨床治療的MSCs都來(lái)源于體外培養(yǎng)。研究人員分別對(duì)體外培養(yǎng)p1，p8和p13階段（passage）的來(lái)源于人骨髓MSC采用全基因組測(cè)序(WGS)。WGS結(jié)果顯示在p1和p8階段的培養(yǎng)細(xì)胞中沒有拷貝數(shù)變異（CNV）和非常低頻的單核苷酸突變(SNV)，但是p13階段的SNCs數(shù)目顯著增加，達(dá)到677個(gè)。采用ddPCR對(duì)WGS發(fā)現(xiàn)的8個(gè)非同義突變進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)培養(yǎng)的單核細(xì)胞內(nèi)就含有極低頻對(duì)應(yīng)的突變(0.01%)，在p1和p8階段培養(yǎng)的MSC內(nèi)其突變比例依然處于極低比例狀態(tài)(0.1-1%)，但是在p13培養(yǎng)的階段對(duì)應(yīng)突變的比例顯著地上升到(17-36%)[4]。
6.3 基因表達(dá)分析
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 常用于檢測(cè)基因表達(dá)差異，但該方法一般只能檢測(cè)出兩倍或者更大的差異。而一些研究則需要檢測(cè)低于兩倍的表達(dá)變化。dPCR 的檢測(cè)精度可達(dá)±10%甚至更高，能夠分辨更小的差異。
dPCR尤其適合：基因相對(duì)表達(dá)變化差異較小（<2倍）的研究；低豐度基因或單細(xì)胞的表達(dá)分析，以及RNA編輯、等位基因差異表達(dá)等研究。
圖13. 基因表達(dá)分析相關(guān)方法比較
6.4 拷貝數(shù)變異分析
圖14. 拷貝數(shù)變異
拷貝數(shù)變異 (CNV) 分析的目的是確認(rèn)目的序列的拷貝數(shù)是否偏離野生型序列，以及偏差多少?？截悢?shù)變異與疾?。ò┌Y）、代謝途徑、生物種進(jìn)化等關(guān)系密切。臨床上，CNV可為具體治療方案的制定與修正提供參考；農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)，CNV可作為遺傳育種的遺傳標(biāo)記。
傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)提供了足夠的分辨率，可以鑒別低拷貝數(shù) (如0至5的拷貝數(shù))；但更高的拷貝數(shù)需要更的測(cè)量，以確定確切的拷貝數(shù)。dPCR尤其適用于更高拷貝數(shù)分析，檢測(cè)精度*過(guò)±10%。
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